合理的医薬品設計における共結晶構造の重要性

合理的医薬品設計とは、構造ベースの医薬品設計手法です。医薬品の構造と生体内標的との相互作用を研究することで、酵素活性の阻害、特定の物質の放出促進、チャネルの遮断といった所望の効果を医薬品に付与するものです。このプロセスは標的と医薬品の 3 次元構造の理解に大きく依存するため、構造生物学は医薬品研究に多大な影響を与えてきました。低分子医薬品の設計において、標的タンパク質 - 低分子リガンドの共結晶構造（以下「共結晶構造」）は、医薬品設計プロセスにおいて最も重要な情報となります。

共結晶構造の情報は、結合様式と生物活性コンフォメーションを明らかにし、新たな結合ポケットやアロステリック部位を発見するだけでなく、構造ベース医薬品設計（SBDD）、フラグメントベース医薬品設計（FBDD）、コンピュータ支援医薬品設計（CADD）、AI 駆動型創薬といった合理的医薬品設計のアプローチを豊富にするものです。

創薬開発において極めて重要な共結晶構造の解析において、MicroED は必要な結晶サイズの要件を大幅に低減することで、数多くの実用的なメリットをもたらします。

1.結晶化困難な試料の構造解析成功率を向上させる

2.共結晶構造取得の成功率を大幅に高める

3.研究開発のイテレーション効率を向上させる

4.タンパク質の消費量を削減する

以下の事例で、MicroED の技術的優位性を詳しく説明します。

MicroED 応用のメリット（I）

結晶化困難な試料の構造解析成功率を向上させ、XRD では解明できなかった構造を実現

事例 1：HIV-1 プロテアーゼ

HIV ウイルスの成熟過程において、HIV-1 プロテアーゼは Gag タンパク質を切断し、成熟した HIV ウイルスの集合を促します。そのため、Gag と HIV-1 プロテアーゼの相互作用を遮断することは、有望な治療戦略の 1 つです。低分子阻害剤ベビリマットは、HIV-1 プロテアーゼの活性を阻害するように設計されています。しかし、十分な大きさの結晶試料を取得することが困難なため、これまで X 線結晶構造解析では HIV-1-Gag - ベビリマットの共結晶構造を解明することができませんでした。最終的に、MicroED により HIV-1-Gag - ベビリマット共結晶の構造が解明されたのです。この構造により、ベビリマットとタンパク質の間の静電的相互作用と疎水性相互作用が明らかになり、構造ベースの医薬品設計と、より効果的な阻害剤の開発の基盤が構築されました。

図 1：MicroED 技術により解明された HIV-1-Gag - ベビリマットの構造 [1]

事例 2：MicroED による膜タンパク質構造の解明

膜タンパク質の構造解析は、学界において長年難題とされてきました。脂質キュービック相（LCP）法は膜タンパク質の結晶化を補助することができ、膜タンパク質結晶学の飛躍的な進展をもたらしました。しかし、LCP 技術を用いて成長させた結晶は多くの場合微結晶であり、XRD によるデータ収集には小さすぎる一方、MicroED 技術には非常に適しています。下の画像は、MicroED を用いて解明された GPCR タンパク質 A2AR です。A2AR は重要な創薬標的候補であり、腫瘍、パーキンソン病、薬物依存、精神疾患との有意な関連性が研究により示されています。

図 2：MicroED 技術により解明された膜タンパク質 A2AR の構造 [2]

事例 3：MicroED によるペプチド構造の決定

ペプチドは重要な生物学的機能を持っており、その構造を解明することは生理的メカニズムの理解に不可欠です。しかし、一部のペプチド構造は X 線結晶構造解析では解明できない場合があります。例えば、tau タンパク質の凝集はアルツハイマー病を含むさまざまな神経変性疾患と関連しています。tau タンパク質の VQIINK セグメントは、脳内でのアミロイド線維の凝集と形成を促進するため、このセグメントを阻害することで疾患の進行を停止できる可能性があります。研究者らはこのセグメントの大型結晶の成長を試みましたが、微結晶しか取得できず、X 線による手法ではこのセグメントの結晶構造を解明することができませんでした。最終的に、MicroED 技術を用いて KVQIINKKLD セグメントの 1.1Å 分解能の構造が解明されたのです。解明された構造に基づき、研究者らは一連の阻害剤を設計し、優れた阻害効果を持つものを同定しました。下の画像をご参照ください。

図 3：VQIINK 構造に基づき設計された阻害剤の有意な有効性 [3]

MicroED 応用のメリット（II）

標的タンパク質と低分子の共結晶取得の成功率を大幅に向上

タンパク質と低分子の共結晶を取得する一般的な手法は、ソーキング法です。X 線結晶構造解析では構造解析のために十分な大きさのタンパク質結晶が必要となるため、ソーキングプロセスで大型のタンパク質結晶が破損しやすく、結晶品質の低下や共結晶構造の取得失敗につながります。MicroED ではわずか 100 ナノメートルのタンパク質結晶で十分であるため、低分子ソーキング中の結晶破損の可能性が大幅に低下するとともに、低分子の空間占有率を高めることができます。このように、MicroED はソーキングの成功率と共結晶構造解析の成功率を大幅に向上させることができるのです。

研究者らは、低分子 I3C をソーキングしたプロテイナーゼ K の 4 つの結合ポケットを用いて、タンパク質 - 低分子共結晶の取得における MicroED と X 線結晶構造解析の違いを比較しました。その結果、MicroED ではナノスケールの微結晶を使用するため、低分子がタンパク質のポケットに拡散する効率が非常に高く、4 つの結合ポケットすべてにおいて低分子の占有率が X 線結晶構造解析で解明されたものより優れていることが明らかになりました。下の図をご参照ください。このように、MicroED を用いた微結晶での低分子のソーキング効果は、X 線結晶構造解析に必要な大型結晶の場合よりも有意に優れています。これにより、FBDD、CADD、AI 創薬のプロセスが大幅に加速されることになります。

図 4：タンパク質結合ポケットにおける低分子占有率の比較 [4]

MicroED 応用のメリット（III）

研究開発のイテレーション効率を向上

XRD では大型で完全な結晶が必要となります。多くの場合、大型結晶の取得は困難であり、取得できたとしても欠陥が多く、結晶品質を高めるために複数ラウンドの最適化が必要となります。対照的に、MicroED に必要なナノ結晶は取得が容易で、欠陥が少なく高品質なものが得られることが多いため、大規模な最適化にかかる時間を短縮することができます。

実験室に設置可能な MicroED 機器 vs. 希少な放射光ビームタイム。MicroED 機器は実験室に設置することができ、試料の準備が整い次第、場合によっては同日に試験を実施することができます。一方、放射光施設は国の大型科学装置であり、数週間から数ヶ月に 1 度しかビームタイムが割り当てられません。そのため、試料の準備が完了しても、ビームタイムまで長時間待機する必要が生じることが多いのです。

MicroED 応用のメリット（IV）

タンパク質の消費量を削減

従来の XRD では、タンパク質構造解析のために数百から数千回の結晶化スクリーニングが必要となるため、タンパク質の消費量が多くなります。特に低発現のタンパク質の場合、タンパク質調製のコストは非常に大きなものとなります。対照的に MicroED は、必要な結晶サイズの要件の低さ、完全性の要件の低さ、ソーキング成功率の高さから、必要な結晶化スクリーニングの回数を大幅に削減し、組換えタンパク質の消費量も抑えることができます。

References:

[1]. PURDY M D, SHI D, CHRUSTOWICZ J, et al. MicroED structures of HIV-1 Gag CTD-SP1 reveal binding interactions with the maturation inhibitor bevirimat [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(52): 13258-63.

[2]. MICHAEL W. MARTYNOWYCZ A S, ET AL. MicroED structure of the human adenosine receptor 2 determined from a single nanocrystal in LCP [J]. biorix, 2020,

[3]. SEIDLER P M, BOYER D R, RODRIGUEZ J A, et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation [J]. Nature chemistry, 2018, 10(2): 170-6.

[4]. MARTYNOWYCZ M W, GONEN T. Ligand Incorporation into Protein Microcrystals for MicroED by On-Grid Soaking [J]. Structure, 2021, 29(1): 88-95 e2.