構造生物学は、分子生物学、生化学、生物物理学を融合した学際的な分野です。研究対象はタンパク質や核酸といった生体高分子であり、生物学的または物理学的手法を用いてこれらの分子の構造を解明し、その機能メカニズムを解き明かし、生命活動の理解を深めることを目的としています。さらに、多くの医薬品分子は主にタンパク質と相互作用することから、構造生物学は医薬品研究開発のガイドにおいて重要な役割を果たし、作用メカニズムから創薬までをシームレスにつなぐものです。
生体高分子の中でもタンパク質の研究には、核磁気共鳴法（NMR）、X 線結晶構造解析、極低温電子顕微鏡（Cryo-EM）といった主な研究手法が用いられます。NMR は主に溶液中の分子量が非常に小さい（約 20kDa）試料を対象としています。近年では新たな技術も登場しており、微小電子線回折（MicroED）は極低温電子顕微鏡を用いて微小結晶の構造を解析する技術です。X 線とは異なり、電子線は物質との相互作用がより強いため、X 線結晶構造解析では困難だった課題の解析を可能にし、ナノ結晶構造の解析を実現します。MicroED は、特にこれまで結晶化が困難とされてきたタンパク質試料に対して非常に価値の高い手法です。この革新的なアプローチは既存技術の重要なギャップを埋めるもので、構造生物学者にとって将来性の高い新たなツールとなっています。本技術は『Science』誌により 2018 年のトップ 10 ブレイクスルー技術の 1 つに選出されました。
● X 線回折：伝統的な構造解析手法
1895 年、W.C. レントゲンが X 線を発見しました。X 線の発見は現代生物学の発展を促進し、科学技術の世界に多大な影響を与えました。1912 年、M.V. ラウエ、W. フリードリヒ、レントゲンの弟子である P. クニッピングは硫酸銅結晶の回折実験を実施し、X 線結晶回折において太い楕円形のスポットが記録されたネガを取得しました。その後 ZnS、PbS、NaCl に研究を拡大し、明瞭で対称的な 4 回対称の回折パターンを取得しています。ラウエは結晶における X 線回折を記述するラウエ方程式も提唱しました。
ZnS 結晶の X 線回折写真の発表直後、W.L. ブラッグが実験を再現し、1913 年にブラッグの法則を導き出しました。これらの発見により X 線結晶構造解析が誕生したとされています。1957 年までに、X 線結晶構造解析により初めての生体高分子であるマッコウクジラのミオグロビンの構造が解明されました。現在までに、X 線結晶構造解析により約 15 万種の生体高分子の構造が解明されています。
タンパク質の 3 次元構造解析が急速に進展した背景には、この手法が持つ、原子レベルに近い分解能を実現できること、タンパク質のサイズや組成の制限を超える汎用性を持つという独自の強みがあります。複数サブユニットからなる複合体であっても、分子量の小さいペプチドであっても、この手法は最適な結果をもたらします。一方で、この手法が高品質かつ大型の結晶に依存する点は、その長所であると同時に制限事項でもあります。分子量の大きい分子や柔軟な構造を持つ対象については、このような結晶を取得することが困難です。
● 極低温電子顕微鏡に基づく単粒子解析技術
極低温電子顕微鏡は急速に発展を遂げ、構造生物学に次第に多大な影響を与えるようになりました。この技術の起源は 1930 年代にシーメンス社が初めて市販の電子顕微鏡を製造したところにさかのぼります。初期の手法では重金属染色や糖包埋が用いられており、試料のダメージが大きく、観察は室温環境下で実施されていました。
1984 年に J. デュボシェらにより、急速凍結技術（クライオフリージング）が登場しました。この技術は、生体試料を液体窒素温度まで冷却した液体エタンに急速に浸漬するものです。このプロセスにより、適切な氷の厚さで試料が良好に保存された凍結試料が得られ、氷層内に均一に分散した生体高分子粒子の数千枚の画像を取得することが可能になりました。これらの 2 次元画像をアルゴリズムで解析することで最終的に 3 次元構造を取得する手法が、単粒子解析技術です。
近年では、直接電子検出カメラ（DDD）の登場とデータ処理ソフトウェアの発展により、解明された生体高分子の 3 次元構造の数は大幅に増加しています（図 1）。例えば、2020 年 3 月に『Science』に発表された研究では、極低温電子顕微鏡単粒子解析を用いて、ヒト膵臓のグルカゴン受容体（GCGR）がグルカゴンと、異なる種類の三量体 G タンパク質（Gs または Gi1）に結合した構造を、それぞれ 3.7Å、3.9Å の分解能で決定しています（図 2）。この研究の構造データと薬理学的データを組み合わせることで、2 型糖尿病や肥満症の治療に関する重要な知見がもたらされました。
図 1：極低温電子顕微鏡解析の進化：生体高分子構造の変化トレンド
図 2：グルカゴン - GCGR-GS-Nb35 複合体とグルカゴン - GCGR-Gi1-Scfv16 複合体の極低温電子顕微鏡構造
単粒子解析技術は、結晶化に依存することなく膜タンパク質や高分子複合体といった複雑な構造の研究においてブレイクスルーをもたらしました。必要な試料量が少ないという利点も持っています。ただし、試料必要量が少ない反面、試料の均一性を確保することが依然として大きな課題となっています。検出器とアルゴリズムの改良により、この技術は 2Å 近い分解能を達成するまでに進歩していますが、このような高分解能の実現は比較的まれで、通常は 3Å 前後の分解能で構造が解明されています。それでも、人類の文明の本質は神秘的な自然と科学的真理の探究にあり、さまざまな研究分野の継続的な発展と進歩は、必然的に相互に影響し、推進し合うものです。
● MicroED：結晶学と極低温電子顕微鏡の融合
電子顕微鏡の開発初期には X 線結晶構造解析が隆盛を極め、回折理論とデータ処理手法が次第に成熟していきました。電子顕微鏡と結晶学の組み合わせにより、電子線結晶学が生まれました。2007 年、ストックホルム大学の科学者らが結晶学と電子顕微鏡を巧みに組み合わせ、極低温電子顕微鏡を用いて結晶を可視化することで、重要な新技術である微小電子線回折（MicroED）を開発しました。
MicroED は電子線を用いて微小結晶を回折させ、電子線回折データを収集・解析することでタンパク質の構造を解明する技術です。電子は波長が短いことから物質との散乱能が高く（X 線の 10,000 倍）、達成可能な分解能がより高くなります。さらに、この手法では必要な結晶サイズが非常に小さく、サブミクロンサイズの結晶でも強力な回折シグナルを得ることができ、結晶の大型化が困難な試料に対するブレイクスルーを実現します。
『Science』誌により 2018 年のトップ 10 技術ブレイクスルーの 1 つに認定された MicroED は、初期にはリゾチーム、カタラーゼ、Ca²⁺-ATP アーゼといったモデル試料の構造を原子分解能で解明しました。技術のさらなる発展に伴い、その適用範囲はモデル試料に限定されなくなり、α- シヌクレインコアペプチドや R2lox 酵素といった未知のタンパク質の構造も解析し、最高で約 1Å の分解能を達成しています（図 3）。
2016 年以降、MicroED は急速に発展し、プリオンや FUSLC（肉腫融合低複雑性ドメイン）を含む高分解能のタンパク質構造を解明し、約 1Å の高分解能を取得しています（図 4）。その後、複合体やイオンチャネルといった膜タンパク質を含む、より難易度の高い対象にも MicroED が応用されるようになりました（図 4）。2018 年以降、MicroED は極低温集束イオンビーム（Cryo-FIB）技術と組み合わせることで、これまで X 線結晶構造解析には不適だったやや大きめの結晶を薄片化することが可能になり、MicroED の適用範囲が数十ミクロンの結晶サイズまで拡大し、MicroED と X 線結晶構造解析の間のギャップを埋めるものとなりました。
図 3：MicroED により解析された R2lox の構造
図 4：MicroED の研究統計
● 簡便なプロセス、高分解能、短時間 – MicroED が拓く構造生物学探究の新たな道
X 線結晶構造解析と同様に、MicroED は電子線回折を活用しており、結晶性試料に対する X 線の挙動と同じ原理に基づいています。そのプロセスでは、中間鏡の物面を対物レンズの後焦点面に配置し、この設定により電子線回折スペクトルを増幅し、透過型電子顕微鏡内で回折パターンとして蛍光スクリーンに投影します。透過型電子顕微鏡内で MicroED を実用的に応用するには、結像モードと回折モードの中間鏡を事前に設定しておき、「回折ボタン」を押すだけで 2 つのモードを切り替えることができます。MicroED は構造生物学研究において非常に価値の高いツールです。
MicroED の独自の強みは、生体高分子にとどまらず、低分子化学物質、天然物、医薬品製剤にまで応用範囲が広がる点にあります。粉末状の化学物質に対してもこの技術が適していることは、その研究対象の範囲と完全に一致しており、通常数時間以内という非常に短い時間で構造情報を抽出することができます。MicroED を用いて低分子化学物質を研究した数多くの成功事例が、その効率性と応用可能性を実証しています（図 6）。生体高分子と低分子医薬品の両方に MicroED が応用されていることは、構造生物学における大きな応用可能性を示しており、構造生物学者に将来性の高い強力なツールを提供するものです。
図 5：MicroED のワークフロー
図 6：MicroED により取得された低分子化学物質・天然物の例
結論として、X 線結晶構造解析、極低温電子顕微鏡単粒子技術、そして新たに登場した MicroED 技術のいずれも、科学者たちが継続的な試行と最適化を通じて次第に技術を進化させてきたものです。これらの技術は技術面と研究範囲の面で相互に補完し、推進し合い、人類を自然の真理にさらに近づけるとともに、ライフサイエンスの発展をリードし続けています。商業用の構造生物学試験サービスにおいて、ReadCrystal は先進的な MicroED 試験プラットフォームを強みとし、国際的な規模で単結晶 X 線構造解析（SCXRD）と極低温電子顕微鏡単粒子解析（CryoEM-SPA）の試験サービスを提供しています。
Reference
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