IRED（イミン還元酵素）は、工業的触媒反応において重要な酵素の一つです。
本事例で用いられたIREDは、構造生物学データに基づくセミラショナルデザイン（半合理的設計）により取得されました。
高い相同性を持つ参照構造が存在しなかったため、ReadCrystalはde novo位相決定法（デノボフェージング）を用いて、本酵素の構造データを提供しました。
背景
イミン還元酵素（IREDs, Imine Reductases）は、NADPH依存性の酵素であり、イミンを不斉還元してキラルアミンを合成する触媒として利用されます。
しかしながら、IREDsは基質特異性が狭く、これまで合理的な酵素工学（rational engineering）による改変の事例は限られていました。
2022年、中国科学院微生物研究所のShushan Gao教授の研究チームは、国際的な学術誌《Angewandte Chemie》にて、イミン還元酵素IR-G36の構造設計に関する研究成果を発表しました。
この研究では、
1.合理的なキャビティ設計
2.活性部位飽和変異法（CAST）
3.熱安定性工学
といった手法を組み合わせることで、もともと活性が低かったIR-G36を、4193倍の触媒効率を示す高性能変異体M5へと改良することに成功しました。
さらに、変異体M5は多様なアザシクロアルキルアミンの合成に適用可能であり、工業条件下でのヘクトグラムスケールでの反応実証も行われています。
本研究では、セミラショナルデザイン（半合理的設計）手法によって酵素改変が行われました。
具体的には、86種類のIREDの中から最もR選択性（78%）に優れるIR-G36をスクリーニングし、次の進化ステップの標的としました。
その後、構造生物学的手法によりIR-G36の立体構造を決定し、これを基盤として酵素改変を実施。
最終的に、高い触媒効率を示す変異体M5の開発に成功しました。
なお、本研究におけるIRED構造解析は、ReadCrystalによる技術支援のもとで実施されました。
一般的なIRED（イミン還元酵素）の構造解析ステップ
IREDsはタンパク質であるため、その構造決定には以下のようなステップが必要とされます：
結果
1. タンパク質の発現および精製
本研究におけるIR-G36タンパク質の発現には、大腸菌（E. coli）BL21発現系を使用しました。
その後、Ni-NTAアフィニティカラムによる精製を行い、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）により精製を進めました。
2.タンパク質結晶化
IR-G36 WTおよびIR-G36 M5は、シッティングドロップ法により結晶化されました。
図2 IR-G36のWTおよびM5の結晶
3.X線による回折データ収集
回折データはシンクロトロン放射光を用いて取得されました。
図3 回折像
4.構造決定
IR-G36は既知のIREDと40％程度の相同性しかないため、de novo（デノボ）位相決定法を用いる必要がありました。
そのため、セレン（Se）を導入したヘビーアトム結晶誘導体を作製し、単波長異常分散法（SAD法）によりIR-G36野生型（WT）の構造を決定しました。
最終的に得られた構造の分解能は2.4 Åでした。
図4 WT IR-G36と補因子NADP+の複合体の三次元構造
IR-G36 WTの構造をモデルとして用い、分子置換法を用いてIR-G36 M5の構造を決定した。
図5 IR-G36-WT（灰色）の構造とIR-G36-M5（小麦色）の構造の重ね合わせ
参考文献
1.Zhang J, Liao D, Chen R, Sun Z, Lei X, Gao SS. Tuning an Imine Reductase for the Asymmetric Synthesis of Azacycloalkylamines by Concise Structure-Guided Engineering. Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Jun 13;61(24):e202201908.